Kỹ thuật DNA là gì?
DNA (Deoxyribonucleic acid) là phân tử mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức năng và sinh sản của các sinh vật và nhiều loài virus. Ngày nay, DNA được ứng dụng rộng rãi và phổ biến ở nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong lĩnh vực Y Học. Tại Đại học De Montfort University (DMU, Anh Quốc) các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật DNA để phát hiện ra các loài thảo dược được khai thác bất hợp pháp, làm giả trong ngành dược.
Ý nghĩa của nghiên cứu
Hiện nay thuốc có nguồn gốc từ thực vật đang là một trong những dược phẩm được quan tâm và sử dụng rộng rãi trên toàn cầu, tuy nhiên việc pha trộn, làm giả các dược liệu quý và chất lượng đang là một thách thức lớn trong ngành dược. Để hỗ trợ cho việc kiểm soát chất lượng thuốc có nguồn gốc từ thảo dược, mỗi quốc gia đều có quy định và tiêu chuẩn về sản xuất thuốc. Liên minh châu Âu (EU) đã đưa ra chỉ thị thuốc thảo dược truyền thống (Traditional Herbal Registration) (Chỉ thị số 2004/24 / EC) về việc quy định các sản phẩm từ thảo dược phục vụ cho con người, và tất cả các sản phẩm cây dược liệu phải có chứng nhận đăng ký thảo dược truyền thống (THR) in trên bao bì.
Để đạt được THR, nhiều yếu tố phải được chứng nhận, chẳng hạn như việc xác định và xác thực nguyên liệu cây thuốc nguồn gốc đầu vào. Việc này đang được thực hiện bằng phương pháp hình thái học và hóa học, cả hai đều tốn thời gian và tốn kém. Do đó việc ứng dụng các phương pháp dựa trên DNA là một giải pháp thay thế ưu tiên, vì chúng hiệu quả hơn, ít tốn kém, ít tốn thời gian hơn, đòi hỏi ít vật liệu hơn, và có độ tin cậy cao hơn.
Phương pháp thực hiện
Việc xác minh thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được tiến hành qua những bước chính sau:
Xác định thành phần của các loài thảo dược được sử dụng để chế biến thuốc. Tiến hành lấy Gen của loài đó tại ngân hàng Gen để làm đối chứng (Hiện nay trên thế giới đã có hơn 2,600,000 mẫu gen được lưu trữ tại các Viện và Trung tâm nghiên cứu. Mỗi quốc gia sẽ có các đơn vị chức năng lưu trữ và bảo tồn các nguồn gen hỗ trợ cho công tác nghiên cứu và bảo tồn loài).
Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử phân tích DNA để đối chứng giữa DNA của các loài có chứa trong thuốc với DNA của các loài lấy từ ngân hàng Gen. Phương pháp phân tích này được thực hiện qua một số bước cơ bản sau:
Thiết kế đoạn mồi
(Primer design) đây là công đoạn quan trọng quyết định đến sự thành công của nghiên cứu, đoạn mồi sẽ là cơ sở cho việc ứng dụng phương pháp đa mồi (multiplex-PCR) nhằm xác định được nhiều loài có trong hỗn hợp thuốc. Thông thường các đoạn mồi được thiết kế từ 18-20 nucleotide. Nghiên cứu đã sử dụng phần mềm Allele ID để thực hiện. Tiến hành kiểm tra sự tương tác của các đoạn mồi bằng phần mềm AutoDimer v.1.
Phản ứng khuếch đại Gen ban đầu: (Initial PCR)
Dựa vào mồi ban đầu, tiến hành khuếch đại số lượng DNA theo chu kỳ nhiệt (thermal cycler).
Bằng phương pháp này số lượng các cặp mồi sẽ tăng lên theo cấp số nhân 2n.
Tách DNA từ thuốc có nguồn gốc thảo dược
Các mẫu thuốc sẽ được tiến hành tách DNA bằng bộ công cụ DNeasy Plant Mini Kit và bộ TissueLyser. DNA trong thuốc sau khi được tách sẽ bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 2-5oC.
Khuếch đại đa mồi – Multipex-PCR
Để xác định được Gen có trong thuốc làm từ thảo dược, nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR đa mồi (multiplex-PCR). Các mã gen sau khi nhân bản bằng phương pháp trộn và phản ứng khuếch đại gen PCR (Polymerase Chain Reaction). Gen sau khi được khuếch đại, tiếp tục tiến hành điện di mao quản (Capillary electrophoresis) phương pháp này sử dụng phần mềm GeneMapperW ID v3.2 tại đây phản ứng ghép mạch của các nucleotide sẽ giúp xác định được chính xác loài có cùng cấu trúc di truyền DNA. Từ kết quả phản ứng đó sẽ giúp chúng ta phân biệt được thuốc có nguồn gốc từ thảo dược và thuốc có pha lẫn các loài khác hoặc thậm chí là làm giả.
Hiện nay với sự phát triển của công nghệ nên việc phân tích và xác định cấu trúc DNA của một loài được thực hiện một cách nhanh chóng và thuận tiện nhờ vào hệ thống các công cụ và phần mềm hỗ trợ. Ngoài ra, ứng dụng của phương pháp này còn thúc đẩy cho hoạt động bảo tồn tài nguyên dược liệu bằng cách xác định và giám sát việc khai thác các loài thực vật có nguy cơ bị tuyệt chủng.
Tài liệu tham khảo
- Caroline Howard et al. Chinese Medicine 2012, PlantID – DNA-based identification of multiple medicinal plants in complex mixtures, Chinese Medicine, pp (9) DOI: 10.1186/1749-8546-7-18
- http://biomedia.vn/review/mutiplex-pcr.html
